一、介紹

干熱法是制藥行業(yè)公-認(rèn)的去熱原方法。本文介紹了一系列研究，以確定除干熱法外，是否還能用其他方法成功去除熱原。去熱原是指去除或滅活熱原。在實(shí)踐中，通過證明去熱原工藝能夠?qū)⒓?xì)菌內(nèi)毒素降低到可接受的水平來對其進(jìn)行鑒定。與滅菌一樣，去熱原是一個(gè)絕對的術(shù)語，由于測試不敏感，只能在理論上進(jìn)行證明[1]。

玻璃器皿的去熱原在腸胃外藥物的生產(chǎn)中非常重要，因?yàn)闅埩舻臒嵩罱K可能被注射到患者體內(nèi)，導(dǎo)致不良反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)室中，用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的玻璃器皿必須進(jìn)行去熱原處理，以最-大-程-度地減少檢測污染；采樣容器也必須不含熱原，以避免樣品污染和檢測到假陽性結(jié)果[2]。對注射用藥物生產(chǎn)中使用的玻璃器皿構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)的主要熱原物質(zhì)是內(nèi)毒素。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌外壁中含有的天然熱穩(wěn)定脂多糖[3]。它在細(xì)菌細(xì)胞死亡、裂解、生長和增殖過程中釋放到環(huán)境中 [4, 5]。由于其普遍性和效力，內(nèi)毒素被認(rèn)為是最重要的熱原[6]。

與藥物相關(guān)的內(nèi)毒素的一個(gè)問題是它們具有熱穩(wěn)定性，使其能夠抵抗大多數(shù)傳統(tǒng)的滅菌過程，因此需要對活細(xì)胞和內(nèi)毒素進(jìn)行單獨(dú)的測試。。制藥工藝和設(shè)備面臨內(nèi)毒素的風(fēng)險(xiǎn)。因此，去熱原是在藥品制備過程中保持無菌保證的重要因素。有幾種不同的方法來實(shí)現(xiàn)去熱原（包括超濾、離子交換色譜和使用酸堿水解）?？梢哉f，最常見的去熱原設(shè)備是那些使用干熱操作的設(shè)備（例如使用單向熱空氣的去熱原通道，用于準(zhǔn)備初級包裝物品（產(chǎn)品小瓶）以進(jìn)行無菌灌裝[7]。

監(jiān)管機(jī)構(gòu)對去熱原的要求各不相同。歐洲藥典規(guī)定用于熱原測試的玻璃在 250°C 下干熱 30 分鐘，或在 200°C 下干熱 60 分鐘以進(jìn)行去熱原，但對于用于注射用的玻璃器皿的去熱原沒有書面要求 [8]。用于鱟試劑測試的玻璃器皿必須進(jìn)行去熱原處理，使其水平低于測試的靈敏度。USP<1211>和 FDA 指南不包含溫度規(guī)范，但要求內(nèi)毒素從至少 1000個(gè)內(nèi)毒素單位（EU）的起始濃度減少3對數(shù)（log），以進(jìn)行去熱原[9]。

就去熱原反應(yīng)而言，干熱滅活時(shí)，內(nèi)毒素遵循線性對數(shù)減少曲線，直至減少至3對數(shù)。這種破壞持續(xù)發(fā)生但不一定遵循線性回歸后，而是“雙相"減少[10]。

內(nèi)毒素指示劑

使用內(nèi)毒素指示劑評估內(nèi)毒素的減少情況，所述內(nèi)毒素指示劑使用源自大腸桿菌o113:H10的對照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSE）制劑制備的。使用的CSE應(yīng)類似于使用鱟試劑（LAL）方法進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)（BET）所用的內(nèi)毒素，并可追溯到參考標(biāo)準(zhǔn)。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)

行業(yè)內(nèi)對如何制備內(nèi)毒素指示劑存在一些爭議；制備內(nèi)毒素指示劑的方法有兩種，一種是將內(nèi)毒素添加到要去熱原的物品表面并將其烘干，另一種是使用預(yù)先制備好的內(nèi)毒素指示劑來實(shí)現(xiàn)的。 在這兩種方法中，筆者更傾向于第一種方法。因?yàn)閮?nèi)毒素直接用于去熱原的設(shè)備表面[11]，這種方法被認(rèn)為更具挑戰(zhàn)性。

二、研究設(shè)計(jì)

這項(xiàng)研究的目的是確定除干熱法外，是否還能用其他方法成功去除熱原。研究了兩種替代方法：濕熱（高壓滅菌）和苛性堿沖洗，并將結(jié)果與干熱去熱原進(jìn)行了比較。[12]

三、驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)

目前還沒有針對玻璃最終產(chǎn)品容器的藥典內(nèi)毒素耐受限值 (K)，因此本研究采用了醫(yī)療器械的限值，即0.5EU/ml。

四、方法學(xué)

本研究選擇的方法為動(dòng)態(tài)濁度法LAL（鱟試劑）試驗(yàn)（根據(jù)《歐洲藥典》<2.6.14>中的細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)）。LAL試驗(yàn)基于從鱟中分離出來的裂解酶，這種酶在內(nèi)毒素存在的情況下會凝結(jié)成塊[3]。在實(shí)踐中，對于動(dòng)態(tài)濁度法試驗(yàn)，LAL反應(yīng)速率是用達(dá)到預(yù)定的“閾值"光密度所需的時(shí)間來表示的，稱為起始時(shí)間[13]。內(nèi)毒素濃度越高，起始時(shí)間越短。內(nèi)毒素濃度是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)）計(jì)算得出的，該曲線是通過對數(shù)起始時(shí)間與對數(shù)內(nèi)毒素濃度的線性回歸計(jì)算得出的[14]。樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和對照品至少進(jìn)行一式兩份的測試。陽性產(chǎn)品對照回收率應(yīng)在50-200%的范圍內(nèi)。

這項(xiàng)研究使用了用注射用水沖洗過的玻璃瓶，制備了50000 EU/ml的內(nèi)毒素溶液。用0.1ml溶液接種到小瓶中，得到理論上5000EU的加標(biāo)值，并在單向氣流柜中風(fēng)干過夜。之所以選擇0.1 ml的接種量，是因?yàn)橛形墨I(xiàn)報(bào)道，較小的接種量可減少吸附，從而使小瓶中的內(nèi)毒素回收率更高且更穩(wěn)定。制備完成后，將內(nèi)毒素指示劑與兩個(gè)陽性對照一起放置在去熱原裝置中的指-定位置（10 個(gè)內(nèi)毒素指示劑被認(rèn)為足以評估去熱原能力）。

五、處理和測試

共進(jìn)行了三種處理：

1、干熱：將小瓶在250°C的Carbolite烘箱中處理30分鐘?！睹绹幍洹窡嵩瓬y試章節(jié)<151>中規(guī)定，在250°C下加熱不少于30分鐘以去除玻璃器皿和器具的熱原。

2、濕熱：將小瓶在121°C下高壓滅菌30分鐘；該高壓滅菌周期是用于對設(shè)備進(jìn)行消毒的標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)。

3、苛性堿：每個(gè)小瓶用10ml的0.1 mol/L氫氧化鈉沖洗1分鐘。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這種濃度的苛性堿能夠去熱原[17]。進(jìn)行 1 分鐘的清洗是因?yàn)樗强尚械?，并且如果顯示成功的話可以很容易地實(shí)施和進(jìn)行。

除干熱外，每種處理均進(jìn)行三次運(yùn)行，因?yàn)榻Y(jié)果表明，前兩次運(yùn)行后去熱原 100% 成功（正如已建立的成熟技術(shù)所預(yù)期的那樣）。

處理后，每個(gè)小瓶加入5ml緩沖液，并在超聲波浴中超聲處理15分鐘，然后放置在軌道振蕩器上直至測試。在測試之前，將所有瓶子渦旋混合一分鐘。文獻(xiàn)中建議將超聲波處理和渦流相結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)最佳的內(nèi)毒素回收率。

所有樣品均根據(jù) 5.0 EU/ml 至 0.005 EU/ml 范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行重復(fù)檢測。陽性對照、濕熱處理后樣品和苛性堿處理后樣品需要稀釋，以使可檢測的內(nèi)毒素處于標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)。每次檢測至少有一個(gè)處理過的樣品和所有對照組都加了 0.5 EU/ml 的內(nèi)毒素。檢測樣品時(shí)，在裂解反應(yīng)管中用 LAL 試劑水進(jìn)行 1:2 稀釋（對于需要稀釋到標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的樣品和對照組，在檢測過程中還需進(jìn)行 1:2 的稀釋）。對于陽性產(chǎn)品對照，用1.0 EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行1:2稀釋，得到與測試樣品相同的稀釋度，但內(nèi)毒素加標(biāo)量為0.5 EU/ml。陽性產(chǎn)品對照加標(biāo)回收率在50-200%之間表明沒有干擾，稀釋液適合測試。

六、結(jié)果

（一）數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel™和Systat 11™進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用雙向方差分析來檢驗(yàn)三種處理之間是否存在顯著差異。使用學(xué)生t檢驗(yàn)證實(shí)了差異。由于所測得的處理后內(nèi)毒素濃度取決于每次運(yùn)行的初始峰值，因此統(tǒng)計(jì)分析是根據(jù)內(nèi)毒素減少對數(shù)而不是所測得的實(shí)際內(nèi)毒素進(jìn)行的。這種方法降低了檢測到虛假意義的風(fēng)險(xiǎn)，并且不假設(shè)數(shù)據(jù)來自同一人群。

統(tǒng)計(jì)分析表明，干熱是去熱原最-有-效的處理方法，比濕熱和堿處理更能顯著降低內(nèi)毒素。雖然干熱處理是最-有-效的方法，但濕熱處理和苛性堿處理后內(nèi)毒素的平均對數(shù)下降值都是1.7，因此這兩種去熱原方法之間沒有顯著差異。

（二）討論

這項(xiàng)研究檢驗(yàn)了三種不同處理方法對玻璃器皿的去熱原效果。結(jié)果表明，干熱處理能穩(wěn)定地去除所有加標(biāo)瓶中的熱原，使內(nèi)毒素減少 3 個(gè)以上的對數(shù)下降值。這是意料之中的，因?yàn)楦蔁崾且环N普遍接受的去熱原方法。

盡管對干熱破壞內(nèi)毒素的機(jī)制尚未得到明確研究，但這可能是由于高溫導(dǎo)致分子不加選擇地焚燒造成的。 Ludwig和Avis [15] 認(rèn)為這是一種以自由基為介質(zhì)的氧化反應(yīng)，由生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的痕量金屬催化。這項(xiàng)研究表明，采用濕熱法，傳統(tǒng)的高壓滅菌循環(huán)在降低內(nèi)毒素濃度方面的效果遠(yuǎn)不如干熱法。所有經(jīng)過濕熱處理的瓶子都沒有達(dá)到 3-log的去熱原目標(biāo)，而且所有測試瓶子的處理后內(nèi)毒素含量都超過了4 EU/ml。內(nèi)毒素的熱穩(wěn)定性是眾-所-周-知的，傳統(tǒng)的高壓滅菌濕熱處理無法有效去除熱原。有報(bào)道稱，在過氧化氫存在的情況下，通過高壓滅菌可成功去除熱原，這種情況下的破壞被認(rèn)為是由于脂多糖脂質(zhì)A部分的脂肪酸被氧化所致[16]。 此外，長時(shí)間的高壓滅菌也被證明可以成功地去除熱原。這些都是未來研究中可以探索的途徑，但這兩種方法對于一般實(shí)驗(yàn)室來說都不可行。

用氫氧化鈉處理加標(biāo)瓶對內(nèi)毒素有負(fù)面影響，然而，3-log去熱原目標(biāo)無法始終如一地實(shí)現(xiàn)。雖然許多瓶子中的內(nèi)毒素降至低于可接受限值的水平，但這種情況并不一致。應(yīng)當(dāng)注意，苛性堿的清洗是手工進(jìn)行的；因此，去熱原過程中的不一致性可能與可能與混合過程的變化有關(guān)。

苛性堿處理過程中的破壞機(jī)制是由于內(nèi)毒素脂質(zhì)A部分中發(fā)現(xiàn)的酯和酰胺鍵的水解。酯鍵的堿性水解產(chǎn)生醇和酸式鹽稱為皂化，加熱可增強(qiáng)皂化效果[17]。因此，通過在苛性堿處理中加入加熱階段，可能會更有效地減少內(nèi)毒素。

七、結(jié)論

干熱被認(rèn)為是-最有-效的去熱原方法，其效果明顯優(yōu)于濕熱和苛性堿處理法。因此，這項(xiàng)研究支持大多數(shù)文獻(xiàn)中的普遍結(jié)論。

干熱持續(xù)實(shí)現(xiàn)內(nèi)毒素減少超過 3個(gè)對數(shù)級。本研究中的濕熱和堿處理方案不能一致地去熱原。與干熱相比，這兩種替代方法都沒有達(dá)到相同的可量化的內(nèi)毒素破壞水平。

本研究中使用的玻璃瓶在處理前已用注射用水沖洗過。購買的玻璃瓶通常含有雜質(zhì)，需要沖洗?；厥盏牟Ａ髅罂赡苡谢瘜W(xué)和生物沉淀物，可能會扭曲或掩蓋殘留的內(nèi)毒素。

這些雜質(zhì)和殘留物可能會影響玻璃的去熱原處理，應(yīng)在處理前將其去除；因此，有必要制定玻璃器皿去熱原處理的準(zhǔn)備程序。采取措施減少內(nèi)毒素是微生物控制的一個(gè)重要部分，這涉及到藥品加工以及需要制備材料或測試成分的實(shí)驗(yàn)室。這與內(nèi)毒素的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。內(nèi)毒素注射后的病理效應(yīng)是核心體溫迅速升高，隨后出現(xiàn)極快和嚴(yán)重的休克，往往在診斷出病因之前就已經(jīng)死亡[18]。

參考文獻(xiàn)

1.Akers,M.J.,Ketron,K.M.andThompson,B.R.(1982):‘F Value Requirements for the Destruction of Endotoxin in the Validation of Dry Heat Sterilization / Depyrogenation Cycles’, Journal of Parenteral Science and Technology, Vol. 36, No1, January-February 1982, pp23-27

2.Baines, A. (2000): ‘Endotoxin Testing’ in Baird, R. M., Hodges, N. A. and Denyer, S. P. Handbook of microbiological Quality Control, Taylor & Francis, pp144-167

3.Williams, K.L. (2001). Endotoxins: Pyrogens, LAL testing and Depyrogenation 2nd Edition. Drugs and the Pharmaceutical Sciences Volume 111. Marcel Dekker Inc., New York, USA. Chapters 1, 2, 7 & 8.

4.Hecker, W., Witthauser, D. & Staerk, A. (1994). Validation of dry heat inactivation of bacteria endotoxins. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 48 (4): 197-204.

5.Rietschel, E.T. & Brade, H. (1992). Bacterial Endotoxins. Scientific American August 1992: 26-33

6.Cooper, J.F. (2001). The bacterial endotoxins test: past, present and future. European Journal of Parenteral Sciences 6 (3): 89-93

7.Baird, R. (1988): ‘Validation of Dry Heat Tunnels and Ovens’, Pharmaceutical Engineering, Vol. 8, No.2, pp31-33

8.Guy, D. (2003): ‘Endotoxins and Depyrogenation’ in Hodges, N. and Hanlon, G., Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls, Euromed, pp12.1 – 12.15

9.Sandle, T. (2004). Three aspects of LAL testing: Glucans, depyrogenation and water system qualification. PharMIG News 16: 3-12

10.Nakata, T. (1993): ‘Destruction of typical endotoxins by dry heat as determined using LAL assay and pyrogen assay’, J Parenter Sci Technol, Sep-Oct;47(5):258-64

11.Sandle, T. (2011): “A Practical Approach to Depyrogenation Studies using Bacterial Endotoxin", Journal of GXP Compliance, Autumn 2011

12.Plant, I. (1993): ‘Destruction of typical endotoxins by dry heat as determined using LAL assay and pyrogen assay’, J Parenter Sci Technol, Sep-Oct;47(5):258-64

13.Cooper, M.S. (1996). Bacterial Endotoxins. The Microbiological Update 14 (1): 1-4

14.Novitsky, T.J. (1996). Limulus amebocyte lysate (LAL) assays in Automated Microbia

15.Ludwig, J.D. and Avis, K.E. (1990). Dry heat inactivation of endotoxin on the surface of glass. Journal of Parenteral Science and Technology 44 (1): 4- 12

16.Weary, M. & Pearson, F. (1988). A manufacturers guide to depyrogenation. Biopharm 1 (4): 22-29

17.Caroff, M. & Kariban, D. (2003). Structure of bacterial lipopolysaccharides. Carbohydrate Research 338: 2431-2447

18.Tours, N. and Sandle, T. Comparison of dry-heat depyrogenation using three different types of Gram-negative bacterial endotoxin, European Journal of Parenteral and Pharmaceutical Sciences, Volume 13, No-1, 2008, pp17-20+